La culture in vitro en pratique

Nous avons dans un premier temps voulu cloner une orchidée pour changer car nous avons trouvé que le clonage sur la Saintpaulia était trop fréquent. Puis, nous nous sommes finalement décidées à faire cette expérience sur une orchidée et sur une Saintpaulia pour espérer en réussir une des deux. Le but de cette expérience était de comprendre comment fonctionnait la culture in vitro.

• Ethanol
• Bec Bunsen
• Pinces
• Ciseau / Cutter
• Une Saintpaulia
• Une Orchidée
• Flacons stériles
• 400 ml de milieu SP1 = milieu de multiplication végétative 0,2 mg/L d’auxines + 0,2 mg/L de cytokinines + macro et micro éléments, vitamines, acides aminés, saccharose et gélose pour solidifier le milieu.
• 400 ml de milieu SP2 = milieu de développement et d’enracinement (sans facteur de croissance)
• (Les milieux sont fournis en bouteilles de 200 ml en version pré stérilisée à couler.)

Préparation du plan de travail : Il est important de travailler dans des conditions stériles, de ce fait nous nous sommes lavées les mains, nous avons nettoyé le plan de travail avec de l’éthanol, nous avons placé un bec Bunsen allumé au centre de la paillasse, tous les instruments doivent-être nettoyés à l’éthanol et il faut les passer dans la flamme du bec Bunsen avant de les utiliser.

Désinfecter la feuille à cloner : Couper une feuille de Saintpaulia, enlever le pétiole (extrémité de la feuille), laver la feuille à l’eau du robinet, laisser tremper la feuille dans de l’éthanol pendant 5 minutes et recommencer l’opération. Rincer la feuille en la mettant successivement dans quatre verres d’eau déminéralisés et stériles pendant 5 minutes puis faire de même avec une feuille d’orchidée.

Mettre en culture : Découper les deux feuilles en cinq, poser dix flacons à l’horizontal contenant le premier milieu de culture (gel nutritif) à acheter dans kit pour le clonage d'une Saintpaulia. Ouvrir un flacon et y mettre une feuille auprès de la flamme puis le refermer. Passer l’encolure du flacon à la flamme afin de stériliser et le placer à l’horizontal à une température ambiante ou bien à proximité d’un radiateur. Enfin réitérer l’opération avec les autres flacons.

Les premiers flacons contenant une feuille d’orchidée et un milieu nutritif ont moisi car nous n’avions pas incliné les flacons à l’horizontal, cela n’a pas été fait dans des conditions suffisamment stérile visiblement et nous nous sommes certainement trop précipitées dans l'euphorie de cloner une plante. C'est pourquoi nous vous conseillons de bien vous renseigner sur cette expérience, chose que nous avons ensuite faite. C'est pourquoi nous avons décidé de réitérer l’opération en suivant le protocole à la lettre et en le refaisant avec de l’orchidée (Par la technique in vitro, on peut obtenir un grand nombre de plants identiques qui sont d’une qualité sanitaire irréprochable. Ainsi, les Orchidées sont passées au premier rang des plantes horticoles micro propagées. Or nous n'avons pas vu beaucoup d'exemples de clonage d'orchidée et beaucoup réalisé avec le saintpaulia.) et de s'assurer un résultat positif en le faisant sur du Saintpaulia.

Evolution sur les milieux : Au bout d’environ 8 à 10 jours la feuille va commencer à gonfler mais c’est seulement au bout d’environ 4 à 6 semaines qu’apparaissent d’autres micro feuilles. On obtient alors un amas de micro feuilles. Quand on obtient une touffe de feuilles assez importante, alors nous pouvons soit la diviser et la remettre dans un milieu de culture (méthode de micro propagation), soit les transférer dans le milieu d’enracinement (macro et micro éléments, vitamines, acides aminés, saccharose et gélose. C’est un milieu qui sera plus pauvre en nutriments que le milieu de culture). Pour ce faire, séparer la touffe de feuille en deux puis mettre les deux parties dans le milieu d’enracinement, dans les mêmes conditions de stérilité que précédemment. Faire de même avec les autres flacons non moisis (les flacons contenant une feuille d’orchidée sont à jeter car en faisant des recherches nous avons put constater que l’orchidée était trop fragile pour être cloner de cette manière-là, il est donc normal que la feuille d’orchidée ne se soit pas transformé en une touffe de feuilles).

Mise en terre de la plante : Une fois que la plante présente suffisamment de racines il est alors temps de l’extraire délicatement du milieu d’enracinement pour la mettre en terre. Il faut ensuite la recouvrir d'une demi-bouteille en plastique et placer la plante à une température ambiante ou bien à proximité d'un radiateur, en lumière indirect et arroser avec de l'eau déminéralisée régulièrement. Puis, au bout de 10 à 15 jours ouvrir le bouchon. Une semaine à 10 jours plus tard enlever la demi-bouteille pour que la plante puisse s'acclimater à l'air libre. Il est conseillé de mettre un peu de poudre du milieu d’enracinement sur la terre pour augmenter la chance de survie de la plante qui n’est pas très élevée à cette étape. Notre plante n’a d’ailleurs pas survécu, au bout de quelques jours dans la terre, elle a fané.

   Après plusieurs mois d’expériences et de nombreuses recherches, nous pouvons dire que la culture in vitro permet de créer une plante identique à la plante de départ à partir d’un simple morceau de feuille qui va créer des racines et être autonome grâce à un milieu de culture et un milieu d’enracinement. L’avantage de cette culture est que l’on peut obtenir des plantes plus rapidement et en plus grande quantité que par voies naturelles indépendamment des saisons. Seulement, l’inconvénient de cette technique est le nombre important d’échecs de cultures (surtout à notre échelle : TPE Lycée) qui se produisent au cours des différentes étapes de cette reproduction, avant la création d’une plante saine. Nous savons que cette culture peut s’arrêter à toute étape. Dans le milieu de culture par exemple si la feuille ne touche pas assez la gélose qui la nourrit. Ou encore à cause de moisissure qui est dû à la condition de stérilité. Et quand bien même la plante survit à tous ces dangers la mise en terre reste l’étape la plus dangereuse pour la plante. C'est d’ailleurs à cette étape que nous avons dû stopper la culture malgré nos multiples précautions ainsi que nos multiples essais et exemplaires réalisés. Cependant, à une plus grande échelle, nous pouvons dire que la culture in vitro est très bien maîtrisée de nos jours et que son efficacité n’est plus à démontrer.